Elongation Factor TFIIS Prevents Transcription Stress and R-Loop Accumulation to Maintain Genome Stability

Although correlations between RNA polymerase II (RNAPII) transcription stress, R-loops, and genome instability have been established, the mechanisms underlying these connections remain poorly understood. Here, we used a mutant version of the transcription elongation factor TFIIS (TFIISmut), aiming to specifically induce increased levels of RNAPII pausing, arrest, and/or backtracking in human cells. Indeed, TFIISmut expression results in slower elongation rates, relative depletion of polymerases from the end of genes, and increased levels of stopped RNAPII; it affects mRNA splicing and termination as well. Remarkably, TFIISmut expression also dramatically increases R-loops, which may form at the anterior end of backtracked RNAPII and trigger genome instability, including DNA strand breaks. These results shed light on the relationship between transcription stress and R-loops and suggest that different classes of R-loops may exist, potentially with distinct consequences for genome stability.Cancer Research UK FC001166UK Medical Research Council FC001166Wellcome Trust FC001166European Research Council 693327, ERC2014 AdG669898Ministerio de Economía y Competitividad BFU2013-42918-P, BFU2016-75058-

Funktionelle Charakterisierung der RNA-Helikase MOV10

RNA helicases are important regulators of gene expression, which act by remodeling local RNA secondary structures as well as RNA-protein interactions to allow dynamic association of RNAbinding proteins to their targets. Here, I demonstrate that the helicase MOV10 has an ATPdependent 5’ to 3’ in vitro RNA unwinding activity and comprehensively determine the RNAbinding sites of wild- type MOV10 and helicase mutants in human cells using photoactivatableribonucleoside- enhanced crosslinking and immunoprecipitation (PAR-CLIP). I find that MOV10 predominantly binds to 3’ untranslated regions (UTRs) immediately upstream of regions predicted to form local secondary structures and provide evidence that MOV10 helicase mutants are impaired in their ability to translocate 5’ to 3’ on their mRNA targets. MOV10 interacts with UPF1, the key component of the nonsense-mediated decay (NMD) pathway and co-occupies the same RNA sites. Knockdown of MOV10 results in increased mRNA half-lives of MOV10- targeted mRNAs as well as an NMD reporter transcript, suggesting that MOV10 functions in mRNA degradation as an mRNP clearance factor that resolves local secondary structures and displaces proteins from 3’UTRs.RNA-Helikasen können lokale RNA-Sekundärstrukturen sowie Protein-RNA- Interaktionen verändern. Dadurch ermöglichen sie flexible Änderungen der an RNA gebundene Proteine und sind somit wichtige Regulatoren der Genexpression. In dieser Dissertation zeige ich, dass die Helikase MOV10 ATP-abhängig doppelsträngige RNA in 5’ zu 3’-Richtung entwindet. Zudem bestimme ich transkriptomweit die RNA-Bindungsstellen von Wildtyp-MOV10 und Helikasedefizienten Mutanten vermittels Immunopräzipitation von UV-vernetzten Protein-RNAKomplexen (PAR-CLIP). So kann ich darlegen, dass MOV10 vor allem in den nichttranslatierten Regionen am 3'-Ende der Boten-RNA (3’-UTRs) bindet, gleich vor Stellen für die RNA-Sekundärstrukturen berechnet werden. Für die MOV10-Mutanten zeige ich, dass sie sich im Gegensatz zum Wildtyp-Enzym vermutlich nicht auf der RNA fortbewegen können. MOV10 bindet an UPF1, eine Schlüsselkomponente im Abbau von Nonsense-Boten-RNA (NMD) und besetzt die selben RNA-Bindungsstellen wie dieses Protein. Depletion von MOV10 führt zu Stabilisierung von MOV10-gebundenen Boten-RNAs sowie eines NMD- Reportertranskripts. Dies ist ein Hinweis darauf, dass MOV10 den Abbau von Boten-RNA begünstigt, indem es RNA-Sekundärstrukturen in 3'-UTRs entwindet sowie daran gebundene Proteine entfernt

Funktionelle Charakterisierung der RNA-Helikase MOV10

RNA helicases are important regulators of gene expression, which act by remodeling local RNA secondary structures as well as RNA-protein interactions to allow dynamic association of RNAbinding proteins to their targets. Here, I demonstrate that the helicase MOV10 has an ATPdependent 5’ to 3’ in vitro RNA unwinding activity and comprehensively determine the RNAbinding sites of wild- type MOV10 and helicase mutants in human cells using photoactivatableribonucleoside- enhanced crosslinking and immunoprecipitation (PAR-CLIP). I find that MOV10 predominantly binds to 3’ untranslated regions (UTRs) immediately upstream of regions predicted to form local secondary structures and provide evidence that MOV10 helicase mutants are impaired in their ability to translocate 5’ to 3’ on their mRNA targets. MOV10 interacts with UPF1, the key component of the nonsense-mediated decay (NMD) pathway and co-occupies the same RNA sites. Knockdown of MOV10 results in increased mRNA half-lives of MOV10- targeted mRNAs as well as an NMD reporter transcript, suggesting that MOV10 functions in mRNA degradation as an mRNP clearance factor that resolves local secondary structures and displaces proteins from 3’UTRs.RNA-Helikasen können lokale RNA-Sekundärstrukturen sowie Protein-RNA- Interaktionen verändern. Dadurch ermöglichen sie flexible Änderungen der an RNA gebundene Proteine und sind somit wichtige Regulatoren der Genexpression. In dieser Dissertation zeige ich, dass die Helikase MOV10 ATP-abhängig doppelsträngige RNA in 5’ zu 3’-Richtung entwindet. Zudem bestimme ich transkriptomweit die RNA-Bindungsstellen von Wildtyp-MOV10 und Helikasedefizienten Mutanten vermittels Immunopräzipitation von UV-vernetzten Protein-RNAKomplexen (PAR-CLIP). So kann ich darlegen, dass MOV10 vor allem in den nichttranslatierten Regionen am 3'-Ende der Boten-RNA (3’-UTRs) bindet, gleich vor Stellen für die RNA-Sekundärstrukturen berechnet werden. Für die MOV10-Mutanten zeige ich, dass sie sich im Gegensatz zum Wildtyp-Enzym vermutlich nicht auf der RNA fortbewegen können. MOV10 bindet an UPF1, eine Schlüsselkomponente im Abbau von Nonsense-Boten-RNA (NMD) und besetzt die selben RNA-Bindungsstellen wie dieses Protein. Depletion von MOV10 führt zu Stabilisierung von MOV10-gebundenen Boten-RNAs sowie eines NMD- Reportertranskripts. Dies ist ein Hinweis darauf, dass MOV10 den Abbau von Boten-RNA begünstigt, indem es RNA-Sekundärstrukturen in 3'-UTRs entwindet sowie daran gebundene Proteine entfernt